Appunti di genetica
La
genetica è lo studio dell’ereditarietà e di tutti i meccanismi legati alle caratteristiche
dei processi genetici. La genetica classica ha avuto origine nel diciannovesimo
secolo con gli studi dell’abate Mendel ; osservando le caratteristiche delle
piante di pisello, l’abate si rese conto che i caratteri del vegetale non erano
dettati dal caso, ma bensì da leggi rigorose che la natura aveva già scritto
nel suo libro. Debbono però trascorrere circa cinquant’anni per avere studi più
rigorosi dal punto di vista scientifico. Lo studio sui moscerini si rivelò
fondamentale per comprendere come i caratteri erano scritti nella cellula
dell’insetto, come ad esempio il colore degli occhi o la forma delle ali. I
caratteri che si ripetevano con più frequenza furono definiti normali,
le forme insolite mutanti. Lo studio si basava sull’incrocio
sperimentale e sul calcolo aritmetico delle probabilità di frequenza. Questi
studi si completarono nel ventesimo secolo e tutta questa fase prese il nome di
genetica classica. La nuova genetica ha avuto inizio intorno agli anni
cinquanta con la scoperta del DNA ad opera di Watson e Crick, ma bisogna
attendere solamente intorno agli anni settanta per avere la tecniche nota come
Dna ricombinante aprendo le porte all’ingegneria genetica. Per regolamentare
questo delicato tema scientifico, nel 1974 il comitato etico che si era
insediato, decise di limitare gli esperimenti sul Dna ricombinante e
successivamente di are inizio a frequenti incontri per controllare i lavori
delicati perché potevano incidere sulle coscienze degli uomini. La prima conferenza
viene fatta ad Asilomar nel 1975, la discussione verteva sui pericoli per
l’intero pianeta dalle manipolazioni genetiche, come il creare nuove specie
batteriche incontrollabili o le manipolazioni su cibi per alimentazione animale
e umana, o l’impatto sull’ambiente.
Caratteristiche delle cellule
Le cellule sono di due tipi una detta
procariota con nucleo primitivo, l’altra detta eucariota con nucleo sviluppato.
Le prime sono tipiche degli organismi semplici quali i batteri, la seconda è
tipica degli organismi pluricellulare cioè i più evoluti . Le prime cellule
sono dotate di un rivestimento esterno detta parete cellulare non presente
nello secondo tipo dove invece c’è la membrana cellulare. Tra parete e membrana
cellulare c’è una forte differenza dal punto di vista strutturale la prima ha
una forte resistenza alla pressione osmotica, e agli agenti meccanici
costituendo una vera e propria corazza rigida e allo stesso tempo porosa, ma
capace di una risposta immunitaria. Osservata al microscopio elettronico appare
dotata di circonvoluzioni e canali. La molecola di cui è formata viene detta peptidoglicano
chiamato anche mureina. Esso è costituito catene di polisaccaridi con legame beta 1—4
tenute assieme da molecole aminoacidi
che dipendono dal tipo di batterio. Infatti i Gram-positivi contengono
poche sostanze legate alla molecola principale e hanno altre molecole legate
quali gli acidi tecnici, esteri della glicerina con acido fosforico e
gli ossidrili liberi della glicerina vengono legati dalla alanina , dal N-acetil-D-glucosamina,
e dal glucosio alfa. I Gram-negativi sono ricchi di lipoproteine e
lipopolisaccaridi. La differenza è evidente nella colorazione di Gram:
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Soluzioni applicate |
Gram + |
Gram - |
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Violetto di genziana |
Le cellule si colorano di violetto |
Le cellule si colorano di violetto |
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Soluzione di iodio |
All’interno delle cellule si forma un complesso VG-I. Le cellule rimangono violette. |
Le cellule rimangono violette |
|
Alcol etilico |
Le pareti si disidratano il diametro Dei pori si contrae il complesso non Può uscire dalle cellule che rimango No violette |
I lipidi sono estratti dalle pareti cellulari La porosità aumenta ed il complesso VG-I è estratto dalla cellula. |
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Safranina |
Le cellule non sono influenzate rimangono colorate di violetto |
Le cellule assorbono questo colorante diventano rosse. |
In questa tabella sono
riassunte le principali caratteriste delle cellule:
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Gruppi |
Cellula
Procariota |
Cellula Eucariota |
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Struttura del nucleo |
Priva di parete nucleare |
Presenta la parete nucleare |
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Ribosomi |
Presenti, 70S |
Presenti 70S e 80S |
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Mitocondri |
Assenti |
Presenti |
|
Strutture del Golgi |
Assenti |
Presenti |
|
Reticolo endoplasmatico |
Assente |
Presente |
Cromosomi
Il nome deriva dalla parola d'origine greca cromo
che significa colore e soma che significa corpo. Queste strutture si
colorano in fase di preparazione delle cellule. Tutte le specie animali
possiedono lo stesso numero di cromosomi, l’uomo ne possiede 46, il mais 20, il
moscerino della frutta ne possiede otto. I cromosomi sono raggruppati in coppie
così l’uomo ne possiede 23. I due membri di una stessa coppia sono definiti
omologhi. I cromosomi sono ben definiti e visibili quando la cellula si
duplica. Non sono visibili in fase di stasi. La parte centrale del cromosoma si
chiama centromero, le estremità si chiamano telomeri. Il processo di divisione del cromosoma viene
detto mitosi . Le cellule che contengono i cromosomi omologhi
sono dette diploidi. Le cellule che contengono un solo cromosoma sono
dette apolidi. La meiosi è il processo che porta alla formazione
delle cellule con cromosomi apolidi. Lo schema che porta alla ricombinazione
cellulare durante la fecondazione è riassunta nella pagina posteriore. Ogni
cellula maschile e femminile ricostruisce il proprio corredo da apolide a
diploide. Il sesso è specificato dal cromosoma X e Y. Questi cromosomi sono
così definiti per la loro forma. Analizzando la forma con l’aspetto e la
colorazione dei cromosomi si possono stabilire le eventuali alterazioni. Ad
esempio nella sindrome di Down vi sono tre coppie sul cromosoma 21, si parla di
trisomia del cromosoma 21, nel linfoma di Burkitt vi è un
riarrangiamento sui cromosomi 8 e 14.
Cosa sono i geni
Solo nel 1910 è stato introdotto questo
termine. I geni possono produrre diversi caratteri e le differenti versioni del
gene sono chiamate allele, ad esempio il colore della buccia dei piselli,
dei capelli. Mendel già sapeva che esistono due alleli per ogni carattere
erediatario e che ciascun allele deriva da uno dei genitori. Al momento delle
ricombinazioni
Due
alleli possono essere identici e l’organismo si definirà omozigote, oppure
diversi e quindi eterozigoti. Ad esempio se definiamo i due diversi alleli che
determinano il colore dei semi verdi e giallo avremo le seguenti coppie:
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Colore verde verde |
Omozigote |
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Colore giallo giallo |
Omozigote |
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Colore verde giallo |
Eterozigote |
La stessa
considerazione si può fare per la superficie liscia o rugosa:
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Superficie liscia liscia |
Omozigote |
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Superficie rugosa rugosa
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Omozigote |
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Superficie liscia rugosa |
Eterozigote |
I caratteri si trasmettono in maniera
indipendente, così
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Colore verde superficie liscia |
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Colore giallo superficie rugosa |
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Colore verde superficie rugosa |
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Colore giallo superficie liscia |
Fu Morgan ad individuare gli alleli sui cromosomi, il cromosoma è formato da un filamento unico di DNA. I caratteri si scambiano attraverso porzioni di DNA che si scambiano tramite il crossing-over
Relazione tra geni e proteine
Un gene specifica la sequenza di una proteina e sono le proteine che specificano le funzioni delle cellule ad esempio gli enzimi. Nel 1950 i ricercatori studiando un batterio E.coli fu possibile stabilire che ogni gene specifica una proteina, ma con la scoperta della struttura del DNA fu possibile definire in modo inequivocabile la relazione che esiste tra DNA e proteine. La struttura del DNA era legata alla capacità di riconoscere gli aminoacidi di sequenziali al fine di definire la proteina con senso compiuto. Il gene non era più un'entità astratta, ma una sequenza di nucleotidi ordinata e durante la ricombinazione di DNA provenienti dai genitori si formano nuove combinazioni genetiche quindi nuovi caratteri e nuove proteine.
In natura i geni possono spostarsi
La
risposta è affermativa i geni possono spostarsi da una cellula all’altra. Basti
pensare alla riproduzione dove i geni sono rimescolati originando nuovi
caratteri. Studiando i batteri si può osservare come i geni possono trasferirsi
Trasformazione
batterica
Si intende
l’alterazione del DNA batterico con l’assunzione di segmenti di DNA dal mezzo
di coltura. Fu appunto con questo meccanismo che si riuscì a modificare il
genoma di una cellula batterica, rendendo competente la cellula batterici verso
prodotti o subitati sino allora incogniti. Il gene così trasmesso diventa parte
integrante della cellula ed è trasmesso
alle cellule figlie. La tecnica è valida per le cellule procariote ed
eucariote.
Coniugazione
batterica
Indica il
trasferimento diretto di DNA da una cellula all’altra, tramite contatto con un
ponte che si chiama Pilo sessuale; si parla quindi di passaggio di pezzi
di cromosoma o addirittura di tutto il cromosoma I geni trasferiti sono
integralmente inseriti nel cromosoma il numero di geni trasferiti dipende dal
tempo di contatto tra le cellule. L’inserimento dei geni può avvenire in più
punti della molecola circolare di DNA.
Traduzione
batterica
I
fagi possono acquisire pezzi di DNA dei batteri.
I fagi acquisiscono il DNA batterico frammentato in piccoli pezzi nel corso di
un' infezione, questo frammento va a sostituire il segmento corrispondente nel
DNA della cellula ricevente, che viene trasmesso alle progenie. Il pezzo di DNA virale, può rimanere in fase latente per
molto tempo senza interferire sulla vita della cellula; altrimenti vi può
essere un ciclo litico, dove il virus si avvale delle strutture della cellula
per riprodursi e distruggere la cellula ospite. Il ciclo continua con una nuova
infezione.
I cloni
questi sconosciuti
Per clone
s' intende una popolazione d'organismi geneticamente identici. Tutti gli
individui derivano da un'unica cellula con un unico patrimonio genetico. Il
clonaggio di un virus inizia con l’infezione di una cellula, che porta alla
formazione d'entità simili. E’ possibile creare un numero infinito di cloni.
Tecnicamente è possibile creare dei cloni facendo una semina di cellule in
apposito terreno di coltura contenuto in piastre di Petri.Durante l’infezione è
possibile distinguere le cellule clonate dai virus, perché si formano uno
strato di cellule trasparenti su di uno strato di cellule batteriche non
infettate, fatte crescere nella capsula. Questo è il segnale che si sono
formati i cloni. In questo modo è possibile preparare un numero infinito di
molecole di DNA provenienti da un unico virus e da un'unica cellula batterica,
giacché i virus infettano un'unica cellula batterica.
L’ingegneria
genetica e la tecnica del DNA ricombinante
Si utilizzano
le stesse tecniche viste per la traduzione ovvero pezzi di DNA estraneo si
possono inserire in DNA di cellule riceventi. I pezzi inseriti sono integrati e
fanno parte del patrimonio della cellula acquisendo caratteri nuovi derivati da
più cellule. Diversi sono però i problemi che emergono e cercheremo di
affrontarli uno per volta:
1.
Per
traghettare gli inserti di DNA all’interno della cellula dove replicarsi.
2.
Come
procurarsi gli inserti di DNA che si vogliono studiare o clonare
3.
Come
procurarsi il DNA puro
Alla prima
domanda si può rispondere che osservando la natura si è visto come pezzi di DNA
denominati inserti poteva passare da una cellula all’altra semplicemente
utilizzando dei vettori. Un primo vettore sono le particelle di virus che
aggredendo un batterio possono prelevare dei geni e trasferirli su di un'altra
cellula. Però con il passare del tempo si è visto che in natura vi sono altri
vettori quali i plasmidi che sono polimeri di DNA circolare che si replicano in
modo indipendente dal cromosoma cellulare e possono essere trasferite con il
contatto fra due cellule. I primi risultati misero in evidenza che coniugazione
batterica e plasmidi erano correlati. Per alcuni plasmidi l’efficienza del
processo replicativi è così elevata che all’interno di una sola cellula possono
formarsi migliaia di copie del DNA plasmidico. Oggi l’inserimento di un DNA
inserto con un plasmide viene eseguito in laboratorio operando su soluzioni in
provetta, con un procedimento simile a quello con cui si inseriscono gli inserti
ai vettori fagici. Oggi si inseriscono plasmidi con DNA ricombinante
all’interno delle cellule batteriche. Ogni colonia assumerà un solo plasmide.
La messa a punto di altri plasmidi ha portato alla scoperta di due tipi di
vettori.
1.
I
vettori traghetto
che sono costruiti in modo da replicarsi all’interno di due cellule differenti.
Ad esempio il lievito ed E. coli, possono riprodursi all’interno delle cellule, dove nella cellula
batterica si possono clonare , mentre all’interno della cellula non batterica
possono esprimersi oppure replicarsi.
2.
I
vettori di espressione
che consentono ad un gene clonato di trovare espressione vale a dire essere
trascritto e tradotto. Ad esempio E. coli viene utilizzata per trovare
espressione l’ormone della crescita, il luogo di inserimento è vicino al
promotore per la beta galattosidasi.
Alla
seconda domanda è possibile rispondere poiché intorno al
Nella
prossima tabella sono forniti un esempio d'enzimi ed i siti di taglio:
|
Per avere la sicurezza che un inserto sia stato
assunto dal DNA plasmidico, questi piccoli pezzi di materiale genetico
vengono inseriti nei geni che conferiscono
resistenza agli antibiotici, si
procede alla semina in terreni di coltura contenenti gli antibiotici che
conferiscono resistenza. L’analisi della crescita mi darà la certezza che gli
inserti si sono integrati. Alla terza ed ultima domanda è possibile
rispondere con le tecniche di ultracentrifugazione, colorazione ed analisi
strumentale del DNA, assorbe nel UV, in questo modo dove aver rotto le
cellule con ultrasuoni o azione meccanica, si possono eseguire
centrifugazioni a diverse velocità per purificare il preparato e
successivamente operare un ultracentrifugazione. Oppure si può operare un’
elettroforesi per separare i frammenti di DNA. |
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Bam HI |
G GATCG CCTAG G |
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Eco RI |
G AATTC CTTAA G |
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Hae III |
GG CC CC GG |
|
Hind III |
A AGCTT TTCGA A |
|
Hpa II |
C CGG GGC C |
|
Not I |
GC GGCCGC CGCCGG CG |
|
Pst I |
CTGCA G G ACGTC |
Come è possibile
verificare se l’inserto è stato clonato
Vedere la figura
cinque per essere certi se un inserto è stato introdotto, prendere la
piastra dove sono cresciute le placche fagiche su di un tappeto di cellule,
ricordo che sono aree trasparenti, si posa un disco di nitrocellulosa e si
preme delicatamente, per prelevare un certo numero di cellule. Il disco ora
contiene il DNA fagico dove si ipotizza la presenza del clone, il disco viene
introdotto in una piastra di Petri e trattato alla temperatura di 90° C, in
questo modo il DNA si svolgerà formando due eliche. A questo punto si aggiunge
una sonda di DNA o RNA radioattivo per il fosforo 31 con la medesima sequenza
del gene clonato, si lascia agire un venti minuti, quindi si rimuove la sonda
che non si è legata mediante lavaggio con acqua sterilizzata. Si espone il
disco all’azione dei raggi X, contro una pellicola sensibile ai raggi.
Solamente il clone in cui è avvenuta l’associazione con la sonda, forma una
macchia scura sulla pellicola. E’ quindi possibile evidenziare il clone e la
posizione di origine.
Clonare
il RNA è possibile
Clonare il
RNA è possibile la tecnica prevede l’utilizzo di un enzima denominato trascrittasi
inversa, dove una copia del RNA viene trasformata in DNA complementare. L’enzima
DNA polimerasi sintetizza un secondo filamento. Introducendo il tutto in un opportuno vettore è possibile clonare il
RNA.
La
tecnica del blotting del DNA
Vedere la
figura sei per rendersi conto di questa tecnica e della sua efficacia. Essa
serve per tipizzare inserti di DNA clonati e per definire l’impronta del DNA
studiato. I frammenti di DNA ottenuti dal taglio con più enzimi, vengono
separati mediante elettroforesi. Colorati con specifiche sostanze, al gel viene
sovrapposto un foglio di nitrocellulosa e pressato per fare in modo che
molecole di DNA inserti venga trasferito sul foglio. Il foglio viene mantenuto
ad una temperatura di 90° C per dissociare la doppia elica, e fatto reagire con
una sonda radioattiva di DNA o di RNA. Eliminate le sonde non legate mediante
lavaggio, si sottopone il foglio all’analisi dei raggi X. Risulterà solamente
la banda o le bande, dove si è legata la sonda radioattiva.
La
struttura del gene
I geni
degli eucarioti, sono discontinui ovvero un gene che sintetizza una proteina
non è necessariamente in un unico tratto, infatti vi sono delle sequenze
interposte o introni non
codificanti nessuna proteina, mentre vi sono delle sequenze codificanti dette esoni.
Gli introni vengono rimossi quando l’RNA passa dal nucleo al citoplasma, se
questo processo è difettoso vi possono essere errori gravi nella lettura della
proteina. Alcuni introni possono però raggomitolarsi su se stessi autoscindersi
senza bisogno di enzimi.
Amplificazione
del DNA inserto senza clonazione
La tecnica
della PCR, consente di ottenere in poche ore, milioni di copie di una sequenza
di DNA. Questo è possibile perché viene usata un enzima estratto dal bacillo
turigensis, batterio che cresce nelle acque termali e quindi resistente ad alte
temperature. Le varie fasi sono qui descritte:
1.
I
filamenti vengono svolti mediante riscaldamento
2.
I
filamenti vengono trattati con brevi inserti singoli di DNA presenti in eccesso
3.
Si
aggiunge l’enzima DNA polimerasi
4.
I
brevi inserti fungono da inneschi per l’enzima che dà inizio alla copia.
5.
Al termine di questa fase ciascuno dei filamenti
originali è stato copiato una volta.
6.
Si
ripete il processo nuovamente sino ad ottenere il numero di copie volute.
Vedere la figura
sette per avere un quadro meglio definito. La stesa tecnica può essere
utilizzata per copiare RNA inserti, è necessario trasformare il RNA in DNA e
poi procedere con il modo appena visto.
Clonazione
animale
Era il 27
Febbraio 1977 che alcuni ricercatori di un istituto a Edimburgo, annunciarono
al mondo di aver clonato un animale, con una tecnica stupefacente, i
ricercatori hanno prelevato alcune cellule dalla ghiandola mammaria di una
pecora adulta di razza Finn Dorset di circa sei anni che era all’ultimo
trimestre di gravidanza. Le cellule in coltura sono state resa quiescenti
mediante impoverimento del terreno colturale. A questo stadio è stata prelevata
una cellula uovo non fertilizzata dall’ovaio di un'altra pecora e di tale
cellula è stato asportato meccanicamente il nucleo, contenente il DNA, al suo
posto è stata introdotto il nucleo della prima pecora; questo è stato possibile
con un campo elettrico che rende permeabili la cellula e quindi c’è la
possibilità di introdurre il nucleo. La nuova cellula è stata impiantata
chirurgicamente nell’utero di una terza pecora, con il ciclo pronto ad
accogliere e sviluppare la nuova cellula. Dopo 148 giorni è nata la pecora
chiamata Dolly. Sono state utilizzate ben 277 cellule uovo con inseriti
altrettanti nuclei, solo poche si sono sviluppate, ma solo una cellula ha
sviluppato la pecora. Tale tecnica oggi viene sperimentata sull’uomo per la
clonazione terapeutica, i nuclei contenenti il DNA, trapiantati in cellule con
organismi cellulari nuovi e pieni di energia, possono produrre nuovi tessuti.
Questa tecnica unita a quella del trasferimento dell’embrione, hanno consentito
alla scienza di raggiungere livelli di conoscenza sempre più avanzati. Oggi
grazie alla genetica è già possibile curare malattie che fino a qualche anno fa
erano ritenute inguaribili. Con la possibilità di clonare tessuti umani si
potranno sconfiggere altre malattie che al momento non hanno ancora una cura
efficace.
Fusione cellulare
La parete batterica può essere
depolimerizzata in vari modi un esempio è quello di trattare con il lisozima. I
batteri senza la membrana cellulare vengono detti nudi o protoplasmi, sono
stabili in mezzi isotonici e possono essere indotti a fondersi in soluzioni di
PEG contenenti ioni magnesio. La proprietà fondamentale dei protoplasmi fusi è
che, per incubazione, possono rigenerare la parete batterica, originando un
organismo normale, ma geneticamente alterato. La fusione cellulare consente di
avere un’alterazione genica multipla dove le molecole di DNA si scambiano
attraverso un meccanismo di crossing over pezzi di geni. Il risultato è di
avere un DNA con geni provenienti da entrambi gli acidi. Spesso si nota che se
l’incrocio avviene fra cellule animali da ceppi diversi, spesso si assiste alla
revisione di una delle specie nel giro di poche generazioni. La fusione viene
usata per ottenere incroci fra cellula
animali o vegetali. Un esempio può essere quello che si ottiene incrociando
cellule di mieloma murino con cellule produttrici di anticorpi, per ottenere
ibridomi. Le cellule vengono clonate ed in coltura producono gli anticorpi
monoclinali. Gli ibridomi vengono iniettati nella pancia di topi compatibili,
quest’ultimi sviluppano un tumore e le cellule secernano anticorpi monoclinali in quantità di 20
mg/ml. Oggi si sono sviluppati reattori per la produzione di queste sostanze
per avere maggior quantità di prodotto ed un minor costo.
La selezione viene fatta seguendo questo
protocollo scientifico: le cellule dei due ceppi, vengono trattati con enzimi
litici, si creano i due tipi di protoplasmi; le due cellule vengono mantenute
in due terreni di coltura uno formato da un mezzo minimo per rilevare retro
mutazioni, l’altro terreno è un mezzo completo per determinarne la vitalità. Se
i dati hanno dato esito positivo, si mescolano almeno un milione di ibridomi di
ogni ceppo in soluzione isotonica. Si tratta con PEG e ioni magnesio, si esegue
un lavaggio per eliminare le cellule che non hanno costruito la membrana in
mezzo ipertonico. Si passa ad una revisione delle cellule formate impiantandole
in terreno minimo di coltura ed un terreno completo, in questo modo si possono
eliminare gli eventuali organismi che hanno subito una mutazione.
Tecnica del trasferimento nucleare
La tecnica del trasferimento nucleare consiste nel prendere una cellula di un individuo che non sia in fase di duplicazione, togliere il nucleo utilizzando tecniche conosciute ed inserite in un protocollo, ed inserire il nucleo in un'altra cellula che ne sia stata a sua volta privata del proprio nucleo, normalmente si usa una cellula uovo non fecondata, in questo caso il materiale citoplasmatico è intatto e quindi totipotente, si può duplicare con strutture intatte perché ancora giovani, il nuovo nucleo contiene le informazioni genetiche della cellula di origine in questo caso le cellule che si originano per duplicazione, hanno le stesse caratteristiche della cellula madre. In questo modo si ottengono tessuti identici al donatore di origine; le cellule che si originano sono cellule clonate. Questa tecnica viene utilizzata per ottenere tessuti da donatori con patologie varie è possibile coltivare tessuti che possono essere trapiantati al posto di tessuti danneggiati. Nello stesso modo si ottengono mono strati di cellule. Questa clonazione può in futuro risolvere i problemi che in passato neanche si poteva ipotizzare. Diverso è il caso della pecora clonata, dove è stata creato un nuovo animale. Questa tecnica permette di ottenere solamente parte di tessuti, in futuro si potranno anche avere organi da trapiantare senza problemi di compatibilità o di rigetto e scusate se è poco.
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